食品、添加物等の規格基準の一部を改正する件（平成１８年厚生労働省告示第４５６号）が本日公布され、その内容については、本日付け食安発第０７２８００１号当職通知をもって通知したところである。
　今般、これに関連して、農薬ジノテフランに係る試験法について別添のとおり定め「食品に残留する農薬、飼料添加物又は動物用医薬品の成分である物質の試験法について」（平成１７年１月２４日付け食安発第０１２４００１号当職通知。以下「試験法通知」という。）を改正したので、関係者への周知方よろしくお願いする。
　なお、上記試験法を実施するに際しては、「試験法通知」別添の第１章総則部分を参考とされたい。
　
　
１．分析対象化合物
ジノテフラン

２．装置
紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ（HPLC-UV）
液体クロマトグラフ・質量分析計（LC/MS）

３．試薬、試液
次に示すもの以外は、総則の２に示すものを用いる。
ジノテフラン標準品　本品はジノテフラン99％以上を含み、融点は107.5℃である。

４．試験溶液の調製
１）抽出
穀類、豆類及び種実類の場合は試料10.0ｇに水20 mLを加え、２時間放置する。
果実、野菜及びハーブの場合は試料20.0ｇを量り採る。
茶の場合は試料5.00ｇに水20 mLを加え、２時間放置する。
これにアセトニトリル100 mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、アセトニトリル50 mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、アセトニトリルを加え正確に200 mLとする。この50 mL（茶の場合は10 mL）を40℃以下で約５mLまで濃縮する。

２）精製
① 多孔性ケイソウ土カラムクロマトグラフィー
１）で得られた溶液に水10 mLを加え、多孔性ケイソウ土カラム（20 mL保持用）に流し入れ、10分間放置する。ｎ-ヘキサン100 mLを注入し、流出液は捨てる。次いで酢酸エチル200 mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物に酢酸エチル５mLを加えて溶かす。

② グラファイトカーボンカラムクロマトグラフィー
グラファイトカーボンミニカラム（500 mg）に酢酸エチル５mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに①で得られた溶液を注入した後、酢酸エチル15 mLを注入する。全溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物に酢酸エチル５mLを加えて溶かす。

③ 中性アルミナカラムクロマトグラフィー
中性アルミナミニカラム（1,710 mg）に酢酸エチル５mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに②で得られた溶液を注入した後、酢酸エチル15 mLを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトン20 mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物を水に溶解し、穀類、豆類、種実類及び茶の場合は正確に１mL、果実、野菜及びハーブの場合は正確に２mLとしたものを試験溶液とする。

５．検量線の作成
ジノテフラン標準品の0.025～0.5 mg/L水溶液を数点調製し、それぞれ40μLをHPLCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

６．定量
試験溶液40μLをHPLCに注入し、５の検量線でジノテフランの含量を求める。

７．確認試験
LC/MSにより確認する。

８．測定条件
１）HPLC
検出器：UV（波長270 nm）
カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル（粒径３～５μm）、内径4.6 mm、長さ150～250 mm
カラム温度：40℃
移動相：アセトニトリル及び水（１：９）混液
保持時間の目安：８分

２）LC/MS
カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル（粒径３～５μm）、内径２～2.1 mm、長さ150 mm
カラム温度：40℃
移動相：アセトニトリル及び２mmol/L酢酸アンモニウム（１：９）混液
イオン化モード：ESI（＋）
主なイオン（m/z）：203
注入量：２μL
保持時間の目安：５分

９．定量限界
0.01 mg/kg（茶の場合は0.1 mg/kg）

10．留意事項
１）試験法の概要
ジノテフランを試料からアセトニトリルで抽出し、多孔性ケイソウ土カラム、グラファイトカーボンミニカラム及び中性アルミナミニカラムにより精製した後、HPLC-UVで測定、LC/MSで確認する方法である。

２）注意点
① 抽出時、豆類等の試料が十分に分散しない場合には、水で膨潤させた試料にケイソウ土を加えた後、アセトニトリルを加えてホモジナイズし、抽出効率の向上を図る。
② 夾雑成分の多い試料ではHPLC分析において、ジノテフラン溶出後に移動相を十分に流しカラム内に残存する夾雑物を溶出させた後に、次の分析を行う。

11．参考文献
環境省告示第35号「ジノテフラン試験法」（平成14年４月24日）

12．類型
C

ジノテフラン試験法（畜産物）

１．分析対象化合物
ジノテフラン

２．装置
紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ（HPLC-UV）
液体クロマトグラフ・質量分析計（LC/MS）

３．試薬、試液
次に示すもの以外は、総則の２に示すものを用いる。
多孔性ケイソウ土カラム（５mL保持用）　内径約20 mmのポリエチレン製のカラム管に、５mLを保持することができる量のカラムクロマトグラフィー用に製造した顆粒状多孔性ケイソウ土を充てんしたもの又はこれと同等の分離特性を有するものを用いる。
ジノテフラン標準品　本品はジノテフラン99％以上を含み、融点は107.5℃である。

４．試験溶液の調製
１）抽出
筋肉、脂肪、肝臓、腎臓、その他の食用部分及び乳の場合は、5.00ｇを量り採る。これにアセトニトリル50 mL、アセトニトリル飽和ｎ-ヘキサン50 mL及び無水硫酸ナトリウム10ｇを加え、ホモジナイズした後、毎分3,000回転で５分間遠心分離を行う。アセトニトリル層を採り、ｎ-ヘキサン層及び残留物にアセトニトリル50 mLを加え上記と同様に操作する。得られたアセトニトリル層を先のアセトニトリル層に合わせ、アセトニトリルを加え正確に200 mLとする。この100 mLを40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。

２）精製
① 多孔性ケイソウ土カラムクロマトグラフィー
１）で得られた残留物に水５mLを加えて溶かし、多孔性ケイソウ土カラム（５mL 保持用）に流し入れ、10分間放置する。酢酸エチル50 mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物に酢酸エチル５mLを加えて溶かす。

② 中性アルミナカラムクロマトグラフィー
中性アルミナミニカラム（1,710 mg）に酢酸エチル５mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに①で得られた溶液を注入した後、酢酸エチル10 mLを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトン20 mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物を水に溶解し、正確に１mLとしたものを試験溶液とする。

５．検量線の作成
ジノテフラン標準品の0.025～0.5 mg/L水溶液を数点調製し、それぞれ40μLをHPLCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

６．定量
試験溶液40μLをHPLCに注入し、５の検量線でジノテフランの含量を求める。

７．確認試験
　LC/MSにより確認する。
８．測定条件
１）HPLC
検出器：UV（波長270 nm）
カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル（粒径３～５μm）、内径4.6 mm、長さ150～250 mm
カラム温度：40℃
移動相：アセトニトリル及び水（１：９）混液
保持時間の目安：８分

２）LC/MS
カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル（粒径３～５μm）、内径２～2.1 mm、長さ150 mm
カラム温度：40℃
移動相：アセトニトリル及び２mmol/L酢酸アンモニウム（１：９）混液
イオン化モード：ESI（＋）
主なイオン（m/z）：203
注入量：２μL
保持時間の目安：５分

９．定量限界
0.01 mg/kg

10．留意事項
１）試験法の概要
ジノテフランを試料からアセトニトリルで抽出し、ｎ-ヘキサンで洗浄後、多孔性ケイソウ土カラム及び中性アルミナミニカラムで精製した後、HPLC-UVで測定、LC/MSで確認する方法である。

２）注意点
夾雑成分の多い試料ではHPLC分析において、ジノテフラン溶出後に移動相を十分に流しカラム内に残存する夾雑物を溶出させた後に、次の分析を行う。

11．参考文献
環境省告示第35号「ジノテフラン試験法」（平成14年４月24日）

12．類型
C